Analisis Protein (Metode)

ANALISIS PROTEIN

1.      Metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Metode ini kurang akurat bila diperlukan pada senyawa yang mengandung atom nitrogen yang terikat secara langsung ke oksigen atau nitrogen. Tetapi untuk zat-zat seperti amina,protein,dan lain – lain hasilnya lumayan.

Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen.

Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro.

-          Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g

-          Cara semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen.

Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan.

Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi.

1.      Tahap destruksi

Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.

2.      Tahap destilasi

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP.

3.      Tahap titrasi

Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.

            Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut:

%N = ml NaOH blanko – ml NaOH sampel × N. NaOH × 14,008 × 100%

                      Gram bahan x 1000

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.

            Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut:

%N = ml NaOH blanko – ml NaOH sampel × N. HCl × 14,008 × 100%

                                            Gram bahan x 1000

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

Kadar protein (%) = % N x faktor konversi

Nilai faktor konversi berbeda tergantung sampel:

1.      Sereal                     5,7

2.      Roti                        5,7

3.      Sirup                      6,25

4.      Biji-bijian               6,25

5.      Buah                      6,25

6.      Beras                      5,95

7.      Susu                       6,38

8.      Kelapa                   5,20

9.      Kacang Tanah        5,46

Apabila faktor konversi tidak diketahui, faktor 6,25 dapat digunakan . Faktor ini diperoleh dari fakta rata-rata nitrogen dalam protein adalah 16 %.

Kadar Protein (%)        = N x 100/16

                                    = N x 6,25     

                  Contoh pemeriksaan protein uji Kjeldhal : Analisa Protein Pada Kedelai

1.      Proses Destruksi

·        Ditimbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl, namun karena kandungan protein tinggi pada kedelai  maka digunakan bahan kurang dari 1 g

·        Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.

·        dipanaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan menjadi jernih. ditambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, dimatikan pemanasan dan dibiarkan sampai dingin.

·        Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.

2.      Proses Destilasi

·         Diipasang labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Dipanaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih.

·         Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.

·         Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml.

3.      Proses Titrasi

·         Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.

Ada pun penentuan kadar protein kasar :

Protein Kasar = (y-z) X titar NaOH X 0,014 X 6,25 X 100%

                                   Berat Sampel (x) g

-          Keuntungan Dan Kerugian Menggunakan Metode Kjeldahl

Kentungan menggunakan Metode Kjeldahl,diantaranya :

a.       Secara internasional dan masih merupakan metode standar untuk perbandingan terhadap semua metode lainnya.

b.      presisi tinggi dan baik reproduktifitas telah membuat metode utama untuk estimasi protein dalam makanan.

·           Kerugian menggunakan Metode Kjeldahl,diantaranya :

a.       memberikan ukuran protein yang benar, karena semua nitrogen dalam makanan tidak dalam bentuk protein.

b.      Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena mereka memiliki urutan asam amino yang berbeda.

c.       Penggunaan asam sulfat pekat pada suhu tinggi menimbulkan bahaya yang cukup besar, seperti halnya penggunaan beberapa kemungkinan katalis teknik ini memakan waktu untuk membawa keluar.

2.      Uji Millon

            Alat untuk uji Millon : 3 buah tabung reaksi, Rak tabung, reaksi Pipet tetes, Pipet ukur , dan Waterbath

Bahan – bahan untuk uji millon : Albumin, kasein, gelatin

Prosedur Kerja :

-          siapkan 3 buah tabung reaksi

-          tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 1 ml sampel (albumin;kasein;gelatin)

-           tambahkan 4 tetes reagen millon. Penambahan reagen millon ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan larut protein

-          amati perubahan yang terjadi

-          panaskan dalam waterbath

-          amati perubahan yang terjadi

3.       Uji Biuret

Alat untuk uji biuret : 3 buah tabung reaksi, Pipet tetes, Rak tabung reaksi

Bahan – bahan untuk uji biuret : Albumin, kasein, gelatin

Prosedur Kerja :

-          siapkan 3 buah tabung reaksi

-          tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 1 ml sampel (albumin;kasein;gelatin)

-          tambahkan 1 ml NaOH 0,1 M. Penambahan NaOH 0,1 M ini bertujuan untuk memecah ikatan sulfida yang terkandung di dalam asam amino

-          tambahkan 2 tetes CuSO4 0,1 M. Sebagai donor Cu2+ yang kemudian akan bereaksi dan membentuk cincin ungu.

-          amati perubahan yang terjadi

4.       Uji Pengendapan Alkohol 1 & 2

Alat untuk uji pengendapan oleh alkohol 1& 2 : 6 buah tabung reaksi, Rak tabung reaksi, Pipet ukur, Pipet tetes

Bahan – bahan uji pengendapan oleh alkohol 1& 2 : Albumin, Buffer asetat

Prosedur Kerja :

a.      Uji Pengendapan alkohol 1

-           siapkan 3 buah tabung reaksi

-           tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 5 ml sampel albumin

-          pada tabung pertama tambahkan 1 ml HCl 0,1M, pada tabung kedua tambahkan 1 ml NaOH 0,1M dan pada tabung ketiga tambahkan 1ml buffer asetat

-           pada masing – masing tabung reaksi tambahkan 6 ml etanol 95%

-          amati perubahan yang terjadi

b.      Uji Pengendapan Alkohol 2

-          siapkan 3 buah tabung reaksi

-          tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 5 ml sampel kasein

-          pada tabung pertama tambahkan 1 ml HCl 0,1 M, pada tabung kedua tambahkan 1 ml NaOH 0,1 M, pada tabung ketiga tambahkan 1 ml buffer asetat.

-           pada masing – masing tabung reaksi tambahkan 6 ml etanol 95%

-          amati perubahan yang terjadi

5.      Uji Bradford

Alat untuk uji Bradford (persiapan sampel) : Mortal dan pastleMikropipet Blue tipsEppendorf tubePipet ukur Spektrofotometer

Bahan –bahan uji bradford (persiapan sampel) :Sampel kedelai, bubuk Buffer, tris Reagen bradford

Prosedur Kerja :

-           siapkan 1 gram sampel kedelai (yang telah dihaluskan )

-          masukkan dalam falcon tube

-          tambahkan 5 ml buffer tris. Penambahan buffer tris ini berguna untuk mengekstraksi protein atau melarutkan protein.

-          sentrifuse 5000 rpm selama 5 – 10 menit

-          pindahkan supernatan (bagian yang cair) pada eppendorf tube

-          sentrifuse 12000 rpm selama 5 – 10 menit

-          ambil supernatan 2 µL                            

-          tambahkan 1 ml reagen Bradford

-          ukur absorbansi sampel pada Å 595 nm

Pembuatan Kurva Standart Protein

Alat untuk uji kurva standart protein : Eppendorf tube Mikropipet, Yellow tips, Spektrofotometer

Bahan – bahan untuk uji kurva standart protein : BSA (buffine serum albumin)Tris buffer, Reagen bradford

Prosedur Kerja :

-          siapkan 6 buah eppendorf tube

-          kemudian pada masing – masing eppendorf tambahkan :

Eppendorf

Kons BSA mg/ml

Tris buffer (µL)

Reagen Bradford

-          Vortex, Ukur absorbansi pada Å 595 nm